안녕하세요 바이러스를 생산하는 기업이나 실험실에서 사용할 수 있는 TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose) 실험법을 정리해서 올려보겠습니다 저는 AAV를 생산하는 기업의 연구소에서 일하고 있는데 주 업무가 바이러스 생산과 바이러스 정량을 하는 일이기 때문에 TCID50 실험을 자주합니다 밑에 정리한 SOP 입니다
1. Plate cells
1.1 96well에 50 ul씩 seeding (8x105 cells/ml) 한다
- 7ml cell suspension
1.2 Incubator에서 o/n 배양한다
2. Virus infection
2.1 H5 virus를 SFM에 3.2x108 particles/ml 희석하여 dilution (15ml)을 만든다
2.2 정량할 바이러스 dilution
1x10-2 = 990µl diluent + 10µl stock
1x10-4 = 990µl diluent + 10µl previous dilution
1x10-5 = 900µl diluent + 100µl previous dilution
1x10-6 = 900µl diluent + 100µl previous dilution
1x10-7 = 900µl diluent + 100µl previous dilution
1x10-8 = 900µl diluent + 100µl previous dilution
1x10-9 = 900µl diluent + 100µl previous dilution
★ Negative control: H5 diluent only
2.3 Cell을 배양한 96well에서 배양액 제거한 후 virus dilution을 50 ul 처리한다
2.4 37°C/5% CO2 incubator에서 2시간동안 배양한다
2.5 Complete media를 50 ul씩 adding 후, adhesive air-pore film으로 덮는다
2.6 72 hours in 37°C /5% CO2 incubator (3일)
3. DNA extraction
3.1 96well을 1500rpm, 30초 원심분리한다
3.2 Film을 제거하고 CPE를 확인한다
3.3 85 ul씩의 DNA extraction solution을 넣고 pipetting한다
3.4 adhesive sealing film을 덮고 37°C for 1 hour
3.5 55°C for 2 hour, 95°C for 30 minutes qPCR protocol로 진행한다
3.6 DNA sample은 4°C에서 7일간 보관가능하다
4. qPCR
Standard: 5ul standard dilution + 45ul Mix
Sample: 2.5ul water + 2.5ul sample + 45ul Mix
Negative Control (H5 diluent only): 5ul + 45 ul Mix
즐거운 실험 진행하셔서 좋은 결과 내시길 바랍니다
